Bacterias que comen petróleo (Biorremediación)

#PMBPetroleo

¿Existen las bacterias capaces de degradar el petróleo? ¿Seríamos capaces de utilizarlas en nuestro beneficio para descontaminar zonas afectadas por el petroleo? 

Introducción y definiciones

Lo primero es explicar algunos términos que pueden no ser conocidos. La biorremediación es el uso de cualquier organismo vivo (bacterias, protistas, hongos, plantas...) o algún derivado de ellos (como las enzimas) para retornar un entorno contaminado a su estado original. Cuando se emplean plantas en el proceso de biorremediación se suele emplear el término fitorremediación.

La bioprospección es la búsqueda de microorganismos con potencial biorremediador a un determinado contaminante. Para llevar a cabo esta tarea, se tienen en cuenta algunos puntos importantes como:

• El organismo biorremediador no puede ser patógeno. Por razones evidentes, si disminuyes un contaminante (a priori estático) pero introduces una enfermedad (con capacidad de propagarse y reproducirse) la situación empeora claramente.
• Estudiar la ruta de eliminación del contaminante. Algunos microorganismos, generalmente bacterias, son capaces de degradar el contaminante, pero solo lo hacen parcialmente. De tal formas que sintetizan productos intermediarios, que pueden llegar a ser más tóxicos que el contaminante original.
• Estudiar en qué condiciones el microorganismo puede degradar el compuesto. De nada sirve un microorganismo que elimina el contaminante de forma muy lenta o que incluso el microorganismo, siendo capaz de eliminar el contaminante, no sea capaz de sobrevivir a las concentraciones del contaminante en el entorno a descontaminar. No es lo mismo cultivar en el laboratorio (in vitro) que hacerlo en el entorno natural (ex vivo).

El bioaumento o bioincremento se emplea cuando se conoce una especie o comunidad de microorganismos con capacidad para degradar un contaminante y, mediante mecanismos de biotecnología, cultivar estos microorganismos para inocularlos en la zona contaminada. Este mecanismo parece ideal, tienes a un microorganismo o una comunidad microbiana capaz de eliminar un contaminante y lo puedes usar en cualquier parte. Pero como no hay norma sin excepciones, el problema aquí lo presenta la capacidad de los microorganismos a adaptarse al entorno contaminado. A veces, los cambios del entorno como pH, temperatura, deficiencia de nutrientes, pueden dificultar o impedir el desarrollo del inóculo microbiano. Por tanto, este es un mecanismo muy utilizado para tratar contaminaciones que se controlan en biorreactores, como lo son el tratamiento de aguas residuales (1,2). Dicho de otra forma, es ideal para procesos ex situs (fuera del lugar origen de contaminación)

La solución que a todo el mundo le viene a la cabeza, es estudiar estos elementos para evaluar la aplicación del bioaumento o el bioincremento. Siento decir que no es tan fácil, en ocasiones, los microorganismos autóctonos tienen mecanismos para impedir que se asienten otros microorganismos diferentes, por ejemplo secretando péptidos antimicrobianos, compuestos antibióticos, o inhibidores como quorum quenching. Por tanto, la aplicación del bioaumento o bioincremento se antoja algo más compleja de lo que en principio puede imaginarse una persona.

Otro mecanismo, es la bioestimulación. Este método, consiste en buscar microorganismos con capacidad de eliminar el contaminante (bioprospección) y estimular su crecimiento in situ (en la zona). Aunque a veces, su aplicación tiene sus inconvenientes. Es el más idóneo, porque al ser microorganismos autóctonos, ya están adaptados a la zona, superando los problemas de aplicación in situ que tienen el bioaumento. Aunque una vez aislados, es perfecto emplear el bioaumento con ese microorganismo autóctono para usarlo in situ (3,4).

¿Pueden las bacterias eliminar el petróleo?

Aunque ha habido grandes accidentes medioambientales por vertidos de petróleo al mar, éstos accidentes, no dejan de ser un vertido puntual. Sin embargo, en el mundo se vierten varias toneladas de petróleo al mar por actividades como bombeo de petróleo, transporte marítimo, refinamiento de petróleo o filtración de éste por fugas naturales, etc. Aunque la mayor contaminación por petróleo se produce por vertidos ilegales y accidentes (5). La mayoría de los vertidos accidentales son degradados por los microorganismos nativos en el agua que degradan hidrocarburos del petróleo (6). Gracias a estas bacterias, los mares no están inundados por una fina capa aceitosa de petróleo. Por tanto sí, existen las bacterias que pueden degradar petróleo.

La pregunta obligada es ¿A qué velocidad?¿Lo hacen por completo?¿puede hacerlo una bacteria sola?

¿Que es el petróleo o crudo? El petróleo es una mezcla compleja de compuestos orgánicos, principalmente hidrocarburos. Se han identificado más de 20 000 compuestos orgánicos como componentes del petróleo (7).

Fig. 1: Representación química de algunos componentes del petróleo. Imagen modificada de García-Cruz & Aguirre-Macedo (2014).

¿A qué velocidad los microorganismos son capaces de degradar el petróleo?  Me temo que no es tan fácil como dar una cifra, al ser una mezcla tan compleja y heterogénea, la velocidad de degradación suele depender de la complejidad de la molécula a degradar (el petróleo es diferente en cada zona). Creo que es fácil ver, que una molécula de hidrocarburo lineal, es más fácil y rápido de degradar que un compuesto ramificado. A priori, el orden de degradación/tiempo por composición suele ser: alcanos lineales> alcanos ramificados> compuestos aromáticos pequeños> alcanos cíclicos complejos. Aunque esto está subordinado a otros factores  como pH, temperatura, accesibilidad, genética, etc. (5,8). 

Hay géneros bacterianos que parecen ser exclusivos de la degradación de hidrocarburos, entre los que se encuentran  Oleispira, Oleiphilus, Thalassolituus, Alcanivorax y Cycloclasticus.

Una bacteria muy interesante es Alcanivorax borkumensis. Esta bacteria, es capaz de crecer de forma mayoritaria en aquellas zonas contaminadas por petróleo, por ser una especie cosmopolita y llegando a representar el 80% de las bacterias en zonas contaminadas. A. borkumensis al igual que otras bacterias, necesita generar un entorno que le haga accesible al contaminante, esto lo hace sintetizando exopolisacáridos y pilis, añadiendo unas sustancias denominadas surfactantes. Los surfactantes son sustancias que emulsionan las grasas, en este caso el petróleo, para hacerlo más accesible y degradarlo fácilmente (5). 

Los hidrocarburos lineales como los alcanos, son fácilmente degradables por los microorganismos, mientras que los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), son compuestos recalcitrantes que son difíciles de degradar. Se considera HAP todo compuesto que tiene dos o más anillos aromáticos con ramificaciones. Estos compuestos se generan de forma natural en procesos de combustión como incendios. Por tanto, al ser compuestos que se generan de forma natural en suelos y mares, no es sorprendente que se encuentren microorganismos como procariotas y eucariotas con capacidad de degradar HAP. Alguno de estos géneros son  Arthrobacter, Burkholderia o Pseudomonas (5).

Fig. 2: Representación química del esqueleto principal de algunos hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP). Fuente de la imagen Yi Yim, 2012. Vía www.researchgate.net 

Una de los géneros bacterianos más estudiados en biorremediación es Pseudomonas. Las rutas de degradación del naftaleno, fenantreno y antraceno son relativamente simples y generalmente se encuentran configurados en plásmidos, lo que facilita su herencia a otras especies bacterianas por transferencia horizontal de genes (5).

Un estudio de Fulekar (2017) muestra como el antraceno puede ser degradado de un 65-85% partiendo de una concentración de 500 y 700 mg/L respectivamente en 14 días por parte de consorcios microbianos (2 o más microorganismos). Un análisis posterior usando espectrometría de masas muestra la presencia de  9,10-antraquinona, 1-metoxi-2-hidroxi-antraceno y 6,7-benzocumarina como intermediarios de reacción en la degradación del antraceno. Es dicho estudio, también se evaluó la capacidad de degradar el antraceno por Pseudomonas aeruginosa, esta bacteria es capaz de degradar el 85% de antraceno en 14 días partiendo de una concentración inicial de 500 mg/L, mientras que esta capacidad de degradación disminuye al 35% partiendo de una concentración de antraceno más alta de 750 mg/L. Sin embargo, el antraceno a 200 mg/L fue degradado totalmente en 14 días. Un análisis posterior por espectrometría de masas mostró la presencia de 6,7-benzocumarina, 2,3-dihidroxinaftaleno y catecol como intermedios principales de la degradación . Este estudio muestra cómo la cooperación que se produce en un consorcio microbiano favorece la degradación del compuesto, mientras que una única bacteria, puede verse perjudicada a altas concentraciones del contaminante. Hay que recordar, que estos compuestos son muy complejos y en el proceso de degradación se generan compuestos más tóxicos que los de partida. Por eso, un consorcio microbiano, las bacterias se protegen mutuamente (efecto sinérgico*). Para entendernos, un ejemplo matemático sería: una bacteria A genera un compuesto toxico X, pero este compuesto X no mata a la bacteria A porque es degradado por la bacteria B del consorcio microbiano (9). 

(*)Nota: Def. Sinergia: Los resultados son mayores que la suma de sus partes. 

Estudios de degradación de petróleo en grandes catástrofes ambientales como el de Exxon Valdez o el de BP Deepwater Horizon

El Exxon Valdez fue un vertido de petróleo o crudo en 1989 por un petrolero, mientras que el incidente de BP fue producido en 2010 por un accidente en una estación de extracción de petróleo (figura 3). Ambos fueron en el mar, pero hay diferencias que pueden ser determinantes en el modo de actuación. Mientras que el vertido de Exxon Valdez fue por un barco y vertió el petróleo en la superficie del mar, como lo fue el Prestige en las costas gallegas de España en 2002. El incidente de BP fue en profundidad, produciendo un gran vertido tanto en superficie (al nivel de la plataforma petrolífera), como en las profundidades del mar (nivel de la perforación y extracción de crudo) (10). 

Por otro lado, tenemos la composición de los crudos por su origen orgánico, ya se mencionó que el petróleo es diferente según su formación. El derrame de BP fue causado por un petróleo compuesto por hidrocarburos más ligeros y simples que el derrame producido por el Exxon Valdez. Por tanto, es más fácil de degradar el petróleo del vertido de BP que el de Exxon Valdez por los microbios. Todo esto sin contar diferencias como temperatura, diferencia en los consorcios microbianos nativos y otros factores. Por tanto, la comparación de datos entre los resultados de degradar un derrame de petróleo y otro no tendría sentido (10). 

Fig. 3: Representación de vertidos en el mar. A) Vertido Exxon Valdez (1989). B) BP Deepwater Horizon (2002). Imagen recortada de Atlas & Hazen (2011).

En esta catástrofe medioambiental que afectó al Golfo de México (42 millones de litros de petróleo) se realizaron pruebas de biodegradación de los consorcios microbianos autóctonos en la zona. Se empleó la bioestimulación mediante la aplicación de nitrógeno en fertilizantes (en total 48 600 Kg). Esto representa el mayor uso de biorremediación usado hasta la fecha (10). Por ello, su evaluación y seguimiento sirve como referencia en otras catástrofes similares para determinar cuándo es útil o no el uso de la biorremediación. Estudios realizados 18 y 20 años después del accidente parecen coincidir en que la biorremediación es poco efectiva tras la desaparición del 70% de los HAP. Esto se basa en experimentos donde se usa la aplicación de nutrientes a ese nivel de degradación de HAP (10,11).

También influye la accesibilidad en el terreno, los granos finos de arena provocan un bajo flujo de agua y nulo tráfico de oxígeno y nutrientes. Por tanto, los microbios no tiene acceso al contaminante y la biorremediación se considera ineficaz (10).

En resumen, inicialmente la tasa de degradación de HAP inicial se estimó en un 1%/año. Pero técnicas de tratamiento entre los años 2011-2012 usando peróxido de hidrógeno y nutrientes en 4 playas de Prince William Sound aumentó la tasa de degradación de HAP entre 13 y el 70%. También se vio favorecida la degradación por la inyección de oxígeno y nutrientes en la zona contaminada (12).

En el accidente de BP de 2002, es difícil estimar la enorme cantidad de petróleo vertido, pero algunos cálculos lo estiman en 78 millones de litros. De esta cantidad se estima que el 5% se quemó, el 8% se dispersó químicamente, el 16% se dispersó de forma natural, el 17% se capturó y el 26%-40% se evaporó o disolvió (ver figura 3). 

En este caso se analizaron manchas o "nubes" de petróleo flotantes, donde la presencia de ciertos iones mostraban una posible actividad causada por microorganismos. Posteriormente se determinó que la presencia de microorganismos en la "nube" era mayor (10^5/ml) que en el entorno circundante (10^3/ml). Un análisis por qPCR determinó la presencia en la "nube" de 951 subfamilias de 61 filos de bacterias. Pero solo 16 subfamilias de gamma-proteobacterias se enriquecieron significativamente en la "nube" (con 3 familias de Oceanospirillales). Las especies eran psicrófilas ya que a 700m del Golfo de México la temperatura es estable entre los 2-5 ºC. La vida media de los alcanos en experimentos con las "nubes" recogidas varió de 1 a 6 días. También se observó una alta degradación de hidrocarburos aromáticos, < 1 ppb desde la cabeza del pozo tras la liberación de abril a julio. Parece que el papel fundamental fue la dispersión del contaminante por evaporación y disolución (10). 

Resumen y discusión sobre otras técnicas propuestas.

Lo que debe quedar claro, es que en ningún caso la biorremediación sirve para eliminar el contaminante al 100%. La biorremediación NO es una técnica inmediata de descontaminación, es un proceso a medio y largo plazo. Hay que evaluar siempre la posibilidad de poder aplicar esta técnica o no por los diferentes factores bióticos-abióticos.

Hay algunas iniciativas interesantes en la biorremediación del petróleo que habría que valorar en futuras catástrofes medioambientales. Como por ejemplo la inmovilización de consorcios microbianos en una matriz. Parece que a bajas temperaturas, variaciones de pH o salinidad incrementa la capacidad de degradar compuestos del petróleo (13).

También hay estudios de algunas especies de hongos y bacterias con capacidad de degradar estos compuestos (14, 15, 16).

Nota: Si hubiera algún problema con la propiedad intelectual de las imágenes, pónganse en contacto conmigo a través de los comentarios de este blog y/o de la cuenta de twitter @ParaMicroBio . La imagen será retirada inmediatamente. 

Bibliografía:

1. Nzila, A., Razzak, S. A., & Zhu, J. (2016). Bioaugmentation: An Emerging Strategy of Industrial Wastewater Treatment for Reuse and Discharge. International journal of environmental research and public health, 13(9), 846. doi:10.3390/ijerph13090846. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5036679/
2. Pepper, I. L., Gentry, T. J., Newby, D. T., Roane, T. M., & Josephson, K. L. (2002). The role of cell bioaugmentation and gene bioaugmentation in the remediation of co-contaminated soils. Environmental health perspectives, 110 Suppl 6(Suppl 6), 943-6. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1241276/
3. Benyahia, F., & Embaby, A. S. (2016). Bioremediation of Crude Oil Contaminated Desert Soil: Effect of Biostimulation, Bioaugmentation and Bioavailability in Biopile Treatment Systems. International journal of environmental research and public health, 13(2), 219. doi:10.3390/ijerph13020219. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4772239/
4. Betancur-Corredor, B., Pino, N. J., Cardona, S. & Peñuela, GA.(2015). Evaluation of biostimulation and Tween 80 addition for the bioremediation of long-term DDT-contaminated soil. J Environ Sci (China). 2015 Feb 1;28:101-9. doi: 10.1016/j.jes.2014.06.044. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25662244
5. Brooijmans, R. J., Pastink, M. I., & Siezen, R. J. (2009). Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial biotechnology, 2(6), 587-94. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3815313/
6. Yakimov M.M., Timmis K.N. & Golyshin P.N. (2007). Obligate oil-degrading marine bacteria. Curr Opin Biotechnol. 18(3):257-66.DOI: 10.1016/j.copbio.2007.04.006. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17493798.
7. Alan, G. M. & Ryan, P. R. (2004). Petroleomics:  The Next Grand Challenge for Chemical Analysis. Acc Chem Res. 37(1):53-9. DOI: 10.1021/ar020177t. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14730994
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9. Fulekar M. H. (2017). Microbial degradation of petrochemical waste-polycyclic aromatic hydrocarbons. Bioresources and bioprocessing, 4(1), 28. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5493705/
10. Atlas, R. M., & Hazen, T. C. (2011). Oil biodegradation and bioremediation: a tale of the two worst spills in U.S. history. Environmental science & technology, 45(16), 6709-15. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3155281/
11. Atlas, R., & Bragg, J. (2009). Bioremediation of marine oil spills: when and when not--the Exxon Valdez experience. Microbial biotechnology, 2(2), 213-21. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3815841/
12. Boufadel, M. C., Geng, X. & Short, J. (2016). Bioremediation of the Exxon Valdez oil in Prince William Sound beaches. Mar Pollut Bull. 113(1-2):156-164. DOI: 10.1016/j.marpolbul.2016.08.086. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27622928 
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16. Masakorala, K., Yao, J., Cai, M., Chandankere, R., Yuan, H. & Chen, H. (2013). Isolation and characterization of a novel phenanthrene (PHE) degrading strain Psuedomonas sp. USTB-RU from petroleum contaminated soil. J Hazard Mater. 263 Pt 2:493-500. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2013.10.007. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24225588